Институт Медицинской Климатологии
Препараты для световой микроскопии.

Наиболее распространенными и доступными для повседневной практики являются наблюдения микроорганизмов в световой микроскоп. При приготовлении препаратов руководствуются определенными правилами работы с изучаемыми образцами. Препарат помещают на предметное стекло толщиной не более 1,4 мм. Толстое стекло не позволяет хорошо сфокусировать изображение и не годится для работы с иммерсионным объективом, имеющим очень короткое фокусное расстояние. Толщина покровного стекла не должна превышать 0,17 мм. Стекла должны быть тщательно очищены, обезжирены и высушены.

Препараты живых микроорганизмов представляют собой каплю жидкости с микробными клетками, заключенную между предметным и покровным стеклами. При работе с ними иммерсионные системы не используют. Отработанные препараты выдерживают в дезинфицирующем растворе. Существует несколько видов препаратов живых клеток. Препарат «раздавленная капля» готовят, нанося небольшую каплю воды на предметное стекло и размешивая в ней микробные клетки, выросшие на твердой среде. Если культура росла на жидкой среде, на предметное стекло наносят каплю среды с клетками. Затем эту каплю накрывают покровным стеклом. Если покровное стекло плавает на поверхности капли, то избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Для приготовления препарата «микро-культура» на участок предметного стекла, равный по площади покровному стеклу, наносят расплавленную твердую среду. После застывания среды в центр квадрата помещают суспензию клеток микроорганизма. Стекло инкубируют во влажной камере в термостате, а перед микроскопированием накрывают квадрат среды с выросшей микрокультурой покровным стеклом. Препарат «висячая капля» отличается тем, что каплю суспензии клеток наносят на покровное стекло, которое помещают каплей вниз на специальное предметное стекло с лункой. Капля оказывается свободно висящей в пространстве лунки. Для препарата «отпечаток» чистое покровное стекло прикладывают к поверхности колонии и слегка прижимают его пинцетом. Снятое без сдвига покровное стекло помещают отпечатком вниз в каплю воды на предметном стекле.

Препараты живых клеток позволяют изучать естественную форму и сочетания микроорганизмов, а также характер их движения. Недостатками таких препаратов являются их недолговечность и невозможность достижения большого увеличения.

Работать с иммерсионными объективами и повысить контрастность изображения позволяет процедура приготовления фиксированного окрашенного препарата — специальная обработка, включающая несколько обязательных стадий. Для приготовления мазка небольшую каплю клеточной суспензии равномерно распределяют по поверхности обезжиренного предметного стекла. После этого мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. Затем проводят фиксацию препарата. Эта процедура убивает микроорганизмы, делая их более восприимчивыми к окраске, и прикрепляет клетки к стеклу. Препарат становится безопасным для исследователя, что важно при работе с патогенными микроорганизмами. Различают термическую и химическую фиксацию. Термическая фиксация — это самый простой и распространенный способ, при котором предметное стекло мазком вверх трижды проводят через пламя горелки. После остывания стекла препарат готов к окрашиванию. Более редкая обработка различными химическими веществами применяется при изучении тонкого строения клеток. В зависимости от целей исследования используют различные виды окраски. Простое окрашивание позволяет лучше рассмотреть форму клетки и определить ее размеры, так как прокрашивается вся клетка. В этом случае чаще всего пользуются такими красителями, как фуксин или метиленовая синь, наливая его раствор прямо на мазок и выдерживая 3—5 мин. Дифференциальное окрашивание применяют для выявления структур и включений клетки. При этом используют краситель (или последовательно несколько красителей), окрашивающий определенную клеточную структуру. Иногда сложные способы дифференциальной окраски могут включать дополнительные процедуры.

Например, при окраске эндоспор препарат нагревают с красителем, окраска на кислотоустойчивость и по Граму предполагает обработку кислотой или спиртом и т.д. После окрашивания препарат многократно промывают водой и высушивают на воздухе или промокают фильтровальной бумагой. На мазок помещают каплю иммерсионного масла и микроскопируют препарат с иммерсионным объективом. В правильно окрашенном препарате фон остается неокрашенным. Иногда применяют негативные красители, не проникающие внутрь клетки и окрашивающие только поле зрения. Так, для выявления капсул используют обычную разбавленную тушь. Капсулы при этом остаются неокрашенными и хорошо видны на темно-сером фоне. Фиксированные окрашенные препараты можно хранить длительное время.

Добавить комментарий